扶芳藤提取物對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織IL-6 含量的影響

扶芳藤提取物對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織IL-6 含量的影響

肖健 王坤 肖艷芬 祝美珍 黃燕

(廣西壯族自治區(qū)南寧市廣西中醫(yī)學(xué)院 廣西南寧 530001)

【摘要】

目的 探討扶芳藤提取物對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷過(guò)程IL-6表達(dá)的影響。

方法 取Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和用藥組,Longa法制作大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型,用酶聯(lián)免疫標(biāo)記法測(cè)定腦組織與血清中IL-6的濃度。

結(jié)果 扶芳藤提取物能降低再灌注3h、6h、12h、24h后大鼠腦組織與血清中IL-6的表達(dá)。結(jié)論 扶芳藤提取物對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與其抑制腦組織與血清中IL-6的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】扶芳藤提取物 腦缺血 IL-6

【中圖分類(lèi)號(hào)】R743.31

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-0742(2008)07(a)-0025-02

表 1 扶芳藤提取物對(duì)缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織中IL-6 含量的影響( ± s,pg/mL)

注：與假手術(shù)組比較,*P <0.01;與缺血再灌注組比較,▲P<0.0126

腦缺血損傷的影響因素很多,包括內(nèi)源性谷氨酸的大量釋放、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的超載、凋亡因子的表達(dá)失控、線粒體的損傷等。此外,包括IL-6在內(nèi)的多種細(xì)胞因子參與了腦缺血損傷中的炎癥反應(yīng),并在再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)線栓法制備大鼠急性腦缺血再灌注模型,利用扶芳藤提取物預(yù)防給藥并觀察其對(duì)再灌注損傷過(guò)程中的IL-6水平的影響,以期進(jìn)一步了解扶芳藤在治療腦缺血疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物的制備

取扶芳藤1kg,加入相當(dāng)干藥材10倍量的水,在不銹鋼鍋內(nèi)煮開(kāi)后 1h,過(guò)濾,保留濾液;藥渣再加以 8 倍于生藥量的水,煮開(kāi)后文火煎 30min,過(guò)濾去渣,合并 2 次濾液,濃縮至相當(dāng)于原生藥量的容量即1000mL時(shí),取出冷卻;然后加入95%食用乙醇,邊加邊攪拌,直至藥液中含乙醇為80%時(shí),放置48h,在前24h內(nèi)攪拌3～4次,后靜置24h,過(guò)濾去渣,濾液在旋轉(zhuǎn)回收器中回收乙醇至無(wú)醇時(shí),將無(wú)醇的液體加熱,濃縮成2.0g生藥/mL 的藥物,保留于4℃冰箱,使用時(shí)再用雙蒸水稀釋成所需濃度。

1.2 給藥方式及途徑

藥物組給予扶芳藤提取物灌胃,每100g大鼠每日藥量為2mg,1 次/d,共 2 個(gè)月。各組最后一次給藥均在手術(shù)前 1h 進(jìn)行。

1.3 動(dòng)物與分組

Wistar大鼠96只,雌雄各半,3～5月齡,體重250～300g,由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SCXK桂2003-0003。隨機(jī)分為3組:①假手術(shù)組;②腦缺血再灌注模型組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)模型組);③腦缺血再灌注給藥組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)給藥組)。以上各組均按缺血再灌注3h、6h、12h、24h4個(gè)時(shí)點(diǎn)分成4 個(gè)亞組,每個(gè)亞組8 只大鼠,分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食,喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,飲自來(lái)水。

1.4 動(dòng)物模型的制作

采用改良Zea Longa′ s法[1]制作大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cere-bral artery occulusion,MACO)模型。 大鼠用10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉,仰臥固定,頸部正中線切口,沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣鈍性分離肌肉和筋膜,直到分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈,用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端及頸總動(dòng)脈,然后在距頸總動(dòng)脈近分叉 3～4mm 處剪口,將直徑為0.235mm的釣魚(yú)線自切口輕輕插入,插入深度約為(18.5±0.5)mm,縫合皮膚,皮外留線長(zhǎng)約 10mm。缺血 2h 后,將釣魚(yú)線向外輕輕撥出10mm,即可實(shí)現(xiàn)再灌注。大腦中動(dòng)脈閉塞(MACO)模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn):大鼠蘇醒后表現(xiàn)為:①提尾離地時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲;②在地板爬行時(shí)向右側(cè)劃圈;③站立時(shí)向右側(cè)傾倒。假手術(shù)組按上術(shù)方法施行,但僅分離至頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈后即施行縫合術(shù),不插入釣魚(yú)線。

1.5 標(biāo)本收集

每只模型成功的大鼠按不同缺血時(shí)間點(diǎn)分明過(guò)度麻醉,開(kāi)胸暴露心臟,將灌流針頭經(jīng)左心室插入主動(dòng)脈,先后快速灌入200mL含有 0.01% 肝素的生理鹽水及 200mL4% 多聚甲醛固定液。斷頭取腦,切開(kāi)兩半球,距額極2.5mm 向后切取 2.5mm 的損傷側(cè)腦組織,用電子秤稱(chēng)重后放入玻璃勻漿器,加入10 倍于腦組織重量的4%多聚甲醛進(jìn)行組織勻漿,將勻漿以2000r/min轉(zhuǎn)速離心10min,取上清,封存,置-20℃冰箱待測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

IL-6 的測(cè)定采用雙抗體夾心間接酶聯(lián)免疫吸附法，ELISA),ELISA試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(- χ ±s)表示,組間采用t檢驗(yàn),用SPSS14.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

扶芳藤提取物對(duì)缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織中IL-6含量的影響見(jiàn)表1,與假手術(shù)組比較,缺血再灌注 3h、6h、12h、24h模型組腦組織中IL-6含量明顯升高。與模型組比較,扶芳藤提取物可降低缺血再灌注3h、6h、12h、24h 組 IL-6 水平。

3 討論

IL-6是一種糖蛋白,其分子量介于21～28kD之間,多種淋巴樣細(xì)胞和非淋巴樣細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、成骨細(xì)胞均能產(chǎn)生IL-6,顱內(nèi)IL-6

的主要來(lái)源常被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞[2]。IL-6的表達(dá)在腦組織損傷過(guò)程中發(fā)揮著雙重作用,正常生理濃度或低水平表達(dá)的IL-6對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)的作用,但快速的IL-6含量增高則可加劇神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[3]。Wang等[4]

通過(guò)對(duì)大鼠缺血皮質(zhì)IL-6、c-fos,及zif268mRNA的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),MACO 后 IL-6-mRNA 的表達(dá),3h 顯著增加,12h 達(dá)到頂峰并持續(xù)到24h;提示IL-6可依此時(shí)間段增加蛋白質(zhì)分子的表達(dá)并參與炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中缺血再灌注模型組 IL-6在不同時(shí)點(diǎn)的表達(dá)與文獻(xiàn)資料相似,并提示缺血再灌注損傷可能與IL-6 的持續(xù)高表達(dá)有關(guān)。

扶芳藤是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物,主要分布于我國(guó)西南各省區(qū),具有止血化瘀、舒筋活絡(luò)的功能,近年來(lái)被證實(shí)對(duì)腦缺血再灌注損傷有一定的拮抗作用,祝美珍等[5]實(shí)驗(yàn)表明扶芳藤合劑預(yù)防給藥能對(duì)抗腦缺血再灌注損傷過(guò)程中c-fos蛋白的表達(dá),肖健等[6]則表明上述合劑能拮抗TNF-α的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,扶芳藤提取物預(yù)防給藥后,大鼠腦缺血再灌注 3h、6h、12h、24h 的腦組織中的IL-6含量下降,提示其有減緩大鼠腦缺血再灌注損傷的可能性,但由于大鼠腦缺血再灌注過(guò)程中引起IL-6表達(dá)的因素很多,并且IL-6引起腦組織損傷的機(jī)制尚不明朗,因此扶芳藤提取物對(duì)腦組織的保護(hù)作用還需進(jìn)一步研究。