益智康腦丸對老年性癡呆大鼠行為學(xué)及腦組織Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

伍小燕1＊，李 茂2

（1.廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，南寧市 530023；2.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧市 530022）中圖分類號 R285；R97 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1001-0408（2010）39-3673-03

（2. 

摘 要

目的：探討益智康腦丸對老年性癡呆（AD）大鼠行為學(xué)及腦組織凋亡蛋白的影響。

方法：復(fù)制D-半乳糖AD大鼠模型。實驗分為4組，即空白、模型、益智康腦丸和腦復(fù)康組，檢測大鼠行為學(xué)及腦組織抑制細胞凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表達指標(biāo)的改變。

結(jié)果：模型組與空白組比較，學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，Bcl-2/Bax比值下降；治療組與模型組比較，學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善，Bcl-2/Bax比值增加。

結(jié)論：益智康腦丸具有較好的治療AD作用，其機制可能與促進AD大鼠腦組織Bcl-2的表達、降低Bax 的表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 老年性癡呆；益智康腦丸；行為學(xué)；B細胞淋巴瘤/白血病-2；B細胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白

Effect of Yizhi Kangnao Pills on Ethology and the Expression of Bcl-2 and Bax in Cerebral Tissue of ADRatsWU Xiao-yan（The First Affiliated Hospital of Guangxi College of TCM，Nanning 530023，China）LI Mao（Guangxi Institute of TCM，Nanning 530022，China）

老年性癡呆又稱阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），是指老年老化程度超過生理性老化，或過早老化，致使腦功能障礙，引起獲得性、持續(xù)性智能障礙，是以進行性癡呆為主要

表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。其首要癥狀是智力、記憶力、感官定向能力、判斷力、語言思維能力不可逆的進行性退化，并常伴有性格改變。益智康腦丸用于治療脾腎兩虧、腦髓空虛所致

之老年性癡呆病，臨床應(yīng)用多年，療效顯著。本研究旨在通過復(fù)制老年性癡呆大鼠模型，探討該方對模型大鼠行為學(xué)及神經(jīng)細胞凋亡的影響，以進一步闡明其作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

腦立體定位儀（淮北正華公司）；被動回避反應(yīng)箱（上海騏馳儀器有限公司）；CX31型顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

益智康腦丸（廣西強壽藥業(yè)集團有限公司，批號：060901，每丸重3 g，由0.9％生理鹽水配制為所需濃度）；腦復(fù)康（天津金世制藥有限公司，批號：060318）；促進細胞凋亡基因Bax、抑制細胞凋亡基因Bcl-2免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 動物

健康Wistar大鼠40只，6～7周齡，♀♂兼用，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK 桂 2003-0003）。

2 方法

2.1 模型的復(fù)制

參考文獻

[1]，采取D-半乳糖+喹啉酸（QA）法復(fù)制老年性癡呆大鼠模型。除空白組每日ip 0.5 mL生理鹽水外，其余各組每日ip 0.5 mL D-半乳糖（500 mg·kg-1），連續(xù)7周，復(fù)制大鼠衰老模型。7周后除空白組外，各組大鼠均用1％的戊巴比妥鈉麻醉，固定在腦立體定位儀上，暴露前囟，按腦立體定位圖譜鉆開顱骨，緩慢將微量注射器垂直進入到注射部位，注射lµL 75 nmol·µL-1的QA。注射完畢后，留針10 min，然后緩慢拔針，用牙科泥封堵顱骨上的鉆空。術(shù)后1周各組進行行為學(xué)測試。

2.2 分組及給藥

將40只大鼠隨機分為空白（等量生理鹽水）、模型（等量生理鹽水）、腦復(fù)康（0.7 g·kg-1）和益智康腦丸（4.5 g·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)給藥3周。術(shù)后進行1周行為學(xué)測試后給藥，連續(xù)ig 3周后再進行行為學(xué)測試。

2.3 行為學(xué)測試

采用跳臺法。跳臺裝置為一個25 cm×20 cm×75 cm的被動回避反應(yīng)箱，箱底鋪直徑為1 mm的銅柵，通36 V 交流電，銅柵的一角固定一個8 cm×8 cm×5 cm大小的塑料泡沫塊作為動物回避電擊反應(yīng)的安全區(qū)。先將大鼠放入箱中自由活動5 min熟悉環(huán)境，然后接通銅柵電源，大鼠受到電擊后跳回安全區(qū)以躲避傷害性刺激，然后大鼠再次跳至銅柵上，受到電擊（雙足同時接觸銅柵）又跳回安全區(qū)，如此反復(fù)5 min，記錄每只大鼠首次找到安全區(qū)至第一次跳下安全區(qū)的時間（潛伏期）和5 min內(nèi)受到的電擊次數(shù)（錯誤次數(shù)），作為測試結(jié)果。第1天為學(xué)習(xí)訓(xùn)練期，其后連續(xù)7 d測試，記錄各組大鼠5 min內(nèi)觸電潛伏時間及錯誤次數(shù)，計算其平均值。

2.4 腦組織Bcl-2、Bax含量的測定

[2]在行為學(xué)測試結(jié)束后，進行腦組織取材。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定頭及四肢，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動脈，同時剪開右心耳，依次用Ringer液、4％多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液200 mL灌注固定大鼠，注畢取腦，固定于苦味酸中12～24 h，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟至水，進行免疫組化染色。用蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min后進行微波抗原修復(fù)，用3％ H2O2去離子水孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加正常血清封閉液，室溫孵育 10～15min，傾去，勿洗。每張切片加入 1∶200倍稀釋Bax、Bcl-2抗體，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗后加入生物素化二抗工作液，37 ℃孵育10～15 min，PBS沖洗后加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫孵育10～15 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片，顯微鏡觀察。鏡下觀察，細胞核

與細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞，每組取8個切片，每個切片隨機取5個視野，計數(shù)陽性細胞，取平均值進行比較。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用方差分析；計數(shù)資料率的比較采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)測試結(jié)果

用藥前，與空白組比較，各組大鼠跳臺潛伏期均縮短，錯誤次數(shù)顯著增加（P＜0.05）；用藥后，與模型組比較，益智康腦丸組與腦復(fù)康組大鼠跳臺潛伏期均顯著延長，觸電錯誤次數(shù)

顯著減少（P＜0.05），但兩藥物組之間比較無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，益智康腦丸可以改善模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。各組大鼠跳臺潛伏期比較見表1；各組大鼠跳臺錯誤次數(shù)

比較見表2。

表1 各組大鼠跳臺潛伏期比較（x±s）

Tab 1 Comparison of latency in the step down tes（tx±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05

vs. blank group：＊P＜0.05；vs. model roup：#P＜0.05

表2 各組大鼠跳臺錯誤次數(shù)比較（x±s）

Tab 2 Comparison of incorrect times in the step down test（x±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05

vs. blank group：＊P＜0.05；vs. model group：#P＜0.05

3.2 腦組織Bcl-2和Bax免疫組化結(jié)果與空白組比較，模型組 Bax、Bcl-2 蛋白表達顯著增強（P＜0.01）；與模型組比較，益智康腦丸組與腦復(fù)康組Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著增強（P＜0.01），兩藥物組之間比較無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，益智康腦丸能顯著抑制Bax 蛋白表達，促進Bcl-2 蛋白表達，從而抑制細胞凋亡。各組大鼠腦組織Bcl-2和Bax表達的比較見表3。

表3 各組大鼠腦組織Bcl-2和Bax表達的比較（x±s）

Tab 3 Comparison of the expression of Bcl-2 and Bax incerebral tissue of rats（x±s）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01

vs. blank group：＊P＜0.01；vs. model group：#P＜0.01

4 討論

近年來研究表明，細胞凋亡參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變，與衰老和老年性癡呆的發(fā)生存在著密切聯(lián)系。老年性癡呆神經(jīng)元凋亡的具體機制可能與凋亡相關(guān)蛋白表達失調(diào)等因素有關(guān)。細胞內(nèi)與凋亡有關(guān)的基因分為2類：誘導(dǎo)凋亡基因和抑制凋亡基因。在神經(jīng)細胞凋亡中，Bcl-2家族是不可缺少的，Bcl-2是重要的抗凋亡基因，在細胞色素C的釋放調(diào)控中起重要作用[2]。Bcl-2與Bax是一對相互拮抗的蛋白質(zhì)，它們形成二聚體，拮抗對方的功能，Bcl-2具有明顯抑制凋亡作用，而Bax則促進凋亡。Bax和Bcl-2形成復(fù)合體而失去作用。由此可見，損傷刺激后，Bax和Bcl-2表達的比率在很大程度上影響凋亡的產(chǎn)生[3]。

    益智康腦丸是立足于壯醫(yī)理論而成方，以壯族民間藥物五指毛桃根、扶芳藤為主藥，配合牛大力、千斤拔、紅參、熟地、肉蓯蓉、山藥等諸藥合用，共奏補脾腎、益精血、健腦髓、養(yǎng)“巧塢”之功，臨床用于治療腦髓空虛、“巧塢”失養(yǎng)之老年性癡呆、腦萎縮癥療效顯著

[4]。本研究結(jié)果表明，造模后，在機體的一種自我保護機制下，Bcl-2蛋白表達反應(yīng)性增強，同時啟動了凋亡程序，使Bax表達增強，促進細胞凋亡的發(fā)生。藥物干預(yù)后，Bcl-2表達增強，Bax表達減弱，抑制細胞凋亡。表明益智康腦丸對老年性癡呆的改善作用可能是通過上調(diào)Bcl-2蛋白、下調(diào)Bax蛋白的表達，抑制細胞凋亡而實現(xiàn)，從而改善老年性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

參考文獻

[ 1 ] 齊曦明，韓玉生，周忠光，等.癡呆靈膠囊對老年癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶影響及其機制的實驗研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2004，32（1）：45.

[ 2 ] Wnag HQ，Nakaya Y，Du ZY，et al. Interaction of prese-nilins with FKBP38 promotes apoptosis by reducing mito-chondiral Bcl-2[J].Hum Mol Genet，2005，14（13）：1 889.

[ 3 ] Yao MZ，Nguyen TV，Pike C，et al. B-Amyloid-indu-ced neuronal apoptosis involves c-jun N-terminal ki-nase-dependent downergulation of Bcl-w[J]. Journal Ne-urosci，2005，25（5）：1 149.

[ 4 ] 黃漢儒.中國壯醫(yī)學(xué)[M].南寧：廣西民族出版社，2000：12.

China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 39 中國藥房 2010 年第 21 卷第 39 期

（收稿日期：2010-06-11 修回日期：2010-08-23）

＊碩士研究生。研究方向：藥理學(xué)。電話：029-82655140。E-mail：[email protected]

# 通訊作者：教授，博士。研究方向：新藥藥理評價。電話：029-82655140。